1.1 核酸药物风渐起：继小分子、抗体药物之后的第三大药物范式
核酸药物作用于遗传信息流的上游环节，从根源上干预疾病发生发展。核酸药物开篇要从中 心法则说起，1958 年，英国著名生物学家弗朗西斯·克里克提出生物学领域基石理论—中心 法则：即遗传信息从 DNA 传递给 RNA，再从 RNA 传递给蛋白质，信息传递基本路径包括 DNA 复制、转录及翻译三大过程。作为生命科学领域的核心理论，中心法则为药物开发提 供了理论基础，即基因疗法作用于 DNA 层面，旨在修正或改变 DNA；核酸药物作用于 RNA 层面，影响转录与逆转录等过程；小分子与抗体药物则靶向蛋白质层面，通过调节蛋白质的 功能、稳定性或相互作用来发挥作用。
相比于传统小分子、抗体药物，核酸药物具备靶点范围更广、疗效更持久、研发路径更直接 三大颠覆性优势。与传统小分子和抗体药物直接作用于蛋白质不同，核酸药物在基因转录后 环节进行精准干预，展现出显著优势：其一，基于碱基互补原理对表达相关蛋白质的基因进 行调节，而非与靶点蛋白质进行结合，可突破传统小分子化药、抗体类药物面临的不可成药 靶点的限制问题，靶点范围极大拓宽，理论上任何已知序列的致病基因均可成为药物靶点。 其二，小分子化药、抗体药物作用于疾病通路下游的蛋白质，需持续给药以抑制不断新生的 治病蛋白，在体内的半衰期通常以小时、天、周计，核酸药物可以在体内被循环多次使用， 给药频次更低，半衰期可按月计，疗效更持久。其三，传统药物研发需从复杂的蛋白质三维 结构中寻找结合口袋，而核酸药物设计基于明确的基因序列，只要设计出一段特定的序列， 理论上就可以作为候选药物，研发路径更直接。 核酸药物早期发展相对缓慢，全球首款 ASO 药物诞生于 1998 年，直至 2014 年进入产业 爆发期。1956 年，Rich 和 Davies 依据碱基互补配对原则，发现 RNA 能够形成类似 DNA 的双链结构，从而为 RNA 双链药物的开发奠定了基础，包括 microRNAs（miRNAs）和小 干扰 RNAs（siRNA）。1978 年，Zamecnik 和 Stephenson 使用靶向劳斯肉瘤病毒 35S RNA 的特定寡核苷酸链来抑制病毒复制，标志着反义寡核苷酸（ASO）药物的应用雏形。1998 年，全球首款 ASO 药物福米韦生（Fomivirsen）获美国 FDA 批准上市，用于治疗巨细胞病 毒引起的视网膜炎，标志着小核酸药物正式进入临床应用阶段。2014 年，GalNAc 递送技 术的发现成为激活小核酸药物领域的关键里程碑。2016 年，全球首款 siRNA 药物帕替司兰 （Patisiran）获 FDA 批准上市，用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性多发性神经病。
广义上的核酸药物依据其作用机制可分为三大类，包括作用于核酸以调节蛋白表达的核酸药 物、靶向蛋白质的核酸药物、表达蛋白质的核酸药物。1）作用于核酸以调节蛋白表达：包 括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰 RNA（siRNA）、微小 RNA（miRNA）、小激活 RNA（saRNA） 等，通过调节基因表达发挥治疗作用，如 ASO 可通过 RNase H 介导的降解和空间位阻机 制调控基因表达，代表药物如 Fomivirsen。siRNA 通过 RNA 诱导沉默复合体（RISC）实 现基因沉默，代表药物如 Patisiran。2）靶向蛋白质的核酸药物：主要指核酸适配体（Aptamer）， 能通过独特的三维构象特异性识别和结合目标蛋白。3）表达蛋白质的核酸药物：主要指 mRNA 药物，进入细胞后可表达特定蛋白质，主要有两种策略，其一是蛋白质替代疗法， 通过引入外源 mRNA 来表达或补充功能性蛋白质，其二是 mRNA 疫苗，通过表达抗原蛋 白激活机体免疫反应，用于预防和治疗传染病及肿瘤，代表药物如默沙东/Moderna 的 mRNA-4157。 按分子大小进行分类，核酸药物又可分为小核酸药物和 mRNA 药物。小核酸药物是长度较 短，碱基或碱基对少于 30 的单链或双链核酸药物分子，主要通过碱基互补配对作用于细胞 内的 mRNA；mRNA 药物长度较长，通常大于 100 个核苷酸，主要通过编码蛋白/抗原，指 导细胞合成目标蛋白。
1.2 序列设计：ASO（反义寡核苷酸）与 siRNA（小干扰 RNA）为主流技术路 径
siRNA（小干扰 RNA）结构：双链 RNA
siRNA 序列长度为 20—24 个碱基对（典型为 21 bp），包含一条正义链（非引导链）和一条 反义链（引导链），均具有磷酸化的 5'末端和羟基化的 3'末端，且每条链的 3'端均带有两个 核苷酸的突出端。siRNA 的长度是决定其功能的关键因素，更长的序列可能诱导全局基因沉 默并导致细胞死亡。
siRNA（小干扰 RNA）作用机制：依赖 RISC 复合物，下调基因表达
人工合成的 siRNA 通过内吞作用进入细胞后，从内吞小体逃逸出来，进一步与 Argonaute （AGO）蛋白、Dicer 酶等组装形成 RNA 诱导沉默复合体（RISC），逃逸出的 siRNA 会选 择性的留下反义链，而正义链则被降解，携带反义链的 RISC 结合至靶标 mRNA 后，AGO 蛋白有三个重要结构域 PAZ、MID 和 PIW，其中 PIWI 结构域发挥切割靶标 mRNA 的功能， 被切割的靶标 mRNA 无法再翻译成目的蛋白，最终实现基因的转录后沉默，减少靶蛋白的 合成。
ASO（反义寡核苷酸）结构：单链 RNA
ASO是由15—25个核苷酸组成的，经过某些化学修饰的单链RNA结构，分子量约6—7kDa。
ASO（反义寡核苷酸）作用机制：双重机制，上调或下调基因表达
ASO 进入细胞后通过两种机制发挥作用，其一，在细胞质中通过碱基互补配对原则与靶基 因 mRNA 的 3’端非转录区结合形成双链结构，通过 RNase H1 降解靶基因的 mRNA，从而 抑制或减少目标蛋白的合成。其二，进入细胞核与 pre-mRNA 结合，通过空间位阻效应， 改变剪接体的剪接位置，从而选择性地排除或保留特定的外显子，下调或上调特定蛋白的表 达。
全球小核酸药物领域中，ASO 与 siRNA 占据主导地位，已成为当前主流的技术路径，其他 类型的小核酸药物尚处于早期探索阶段，亟待突破。根据医药魔方的数据，ASO 和 siRNA 是临床研发最为活跃的两类分子，分别开展过 751 项和 631 项全球临床试验，显著领先于 其他类型。Aptamer（适配体）的临床试验数量为 161 项，处于中等水平；而 miRNA、saRNA、 circRNA 的临床试验数量则相对较少，分别为 15 项、7 项和 5 项，研发进展仍较为缓慢。 从研发阶段来看，ASO 总计开展过 104 项 II/III 期及 III 期临床试验，占其总试验数量的约 13.8%；siRNA 则有 96 项 II/III 期及 III 期临床试验，占比约 15.2%。临床试验开展数量可 代表研发热度，ASO与siRNA不仅在临床试验总数上领先，在III期临床数量上也位居前列， 是目前小核酸领域最热门的两种分子，Aptamer 预计将成为仅次于 ASO、siRNA 的第三种 热门技术路径。
1.3 化学修饰：三代修饰技术演进，多种修饰类型提升小核酸成药性
小核酸药物常见的化学修饰分为三类，即磷酸基团修饰、核糖修饰和碱基修饰。构成小核酸 药物的基本单元为核苷酸，在体内极易被核酸酶降解，且存在药代动力学性质差等诸多问题， 一般不能直接连入序列中作为小核酸药物，需经过多位点的化学修饰，针对核苷酸化学结构 的三个基本组成部分，均可进行特定化学修饰，即磷酸基团修饰、核糖修饰和碱基修饰，此 外，其他各种类型的特定修饰也被广泛研究和应用。化学修饰的关键目标是增强小核酸与目 标序列的结合、提高稳定性、优化药代动力学特性以及减少副作用等。 磷酸基团修饰（第一代技术）：提升小核酸稳定性的核心策略之一，其中硫代修饰应用最广 泛。小核酸药物磷酸基团的修饰常在非桥连氧原子上进行，应用较为广泛的是使用硫原子取 代磷酸基团的一个非桥连氧原子，从而形成硫代磷酸酯键，改造后的硫代磷酸酯键存在 Sp、 Rp 两种构型，Sp 构型比 Rp 构型更稳定。硫代修饰有利于提高核酸的抗酶解能力、与血浆 蛋白的结合能力，从而延长其在体内的循环时间，然而不足之处也在于其与靶序列的结合力 较弱，且高含量的硫代磷酸酯键可能会带来细胞毒性和免疫刺激等副作用。除硫代修饰外， 磷酸基团上的氧原子还可被各种胺基、硼烷基取代，或整个磷酸基被酰胺基、胺氧基、烷氧 基、三氮唑基等取代，但这些应用均不如硫代修饰普遍。（关键：核酸酶会切割磷酸二酯键）
核糖修饰（第二、三代技术）：重要性等同于磷酸基团修饰，2'-羟基修饰广泛应用于临床阶 段的小核酸药物。2'位修饰对于抑制核酸酶的水解至关重要，常见修饰主要有两种类型，其 一是在其 2'位引入不同大小和极性的基团，常见的有 2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和 2'-脱氧 -2'-氟等；其二是在 2'位及其他核糖位点同时进行修饰，如锁核酸、PMO 等。（关键：核酸 酶会切割核糖 2’位羟基）
碱基修饰：由于碱基的改动会削弱寡核苷酸与靶标的结合亲和力，或影响碱基配对的精确性， 碱基修饰应用不如磷酸基团修饰、核糖修饰深入。碱基修饰主要分为碱基的取代基修饰和碱 基的替换，嘧啶的 5-位和嘌呤的 8-位是常用的取代位点。常用的碱基修饰类型有假尿苷、 2-硫尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷等。
1.4 递送系统：肝内递送技术成熟，肝外递送拓展小核酸应用边界
目前 GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）共轭偶联和脂质纳米颗粒（LNP）是小核酸药物最主要的 递送系统。根据弗若斯特沙利文，按照不同递送技术分类，小核酸药物递送平台可分为裸露 RNA 修饰递送系统、脂质体纳米递送系统、共轭连接递送系统（小分子配体、抗体及其它 分子）和其它递送系统（无机纳米颗粒、外泌体、聚合物基质、病毒转染等）。
肝内靶向：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联系统为当前公认的主导技术平台和行业金标准。 GalNAc 是一种半乳糖的氨基糖衍生物，能与肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR） 高亲和力结合，而 ASGPR 仅在肝细胞表面高度特异性表达，当 GalNAc 与 ASGPR 结合后， 可通过 ASGPR 和网格蛋白介导的内吞作用，将 GalNAc 从细胞表面高效转运至细胞质，因 此，若将 GalNAc 偶联至 ASO 或 siRNA，即可实现小核酸药物的肝靶向递送。GalNAc 共 轭偶联技术在 ASO 药物和 siRNA 药物中均可应用，是目前为止最有效的小核酸药物肝内递 送系统。
肝外靶向：当前主流路径是对 LNP 进行结构优化，或将小核酸药物与抗体、新型配体偶联。 脂质纳米颗粒 (LNP) 是一种脂质类物质组成的纳米粒子，具有均匀脂质核心，广泛用于小 分子和核酸药物的递送，典型的 LNP 通常由可电离阳离子脂质、胆固醇、PEG 脂质、结构 脂质四个部分构成。LNP 递送系统核心优势在于：其一，载荷通用性强，即从 siRNA 到超 大的 mRNA 均可有效包封，是目前递送 mRNA 的不二之选；其二，胞质递送效率高，可电 离脂质介导的内涵体逃逸效率高，这对于需要在胞质发挥功能的 mRNA 和 siRNA 至关重要； 其三，可工程化，通过改变可电离脂质的结构，可实现肝外靶向。AOC 药物（抗体-寡核苷 酸偶联物）可借助抗体的特异性靶向能力将寡核苷酸递送至特定组织，而利用转铁蛋白受体、 整合素受体等组织特异性表达的受体，设计或筛选对应的新型配体，将其偶联至寡核苷酸， 也可实现特定组织、器官的递送。
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